QIAGEN Plasmid Midi Kits(亲笔翻译中文版)

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QIAGEN Plasmid Midi Kits

实验前准备:

1.使用前将RNase A 加入到Buffer P1。

2.检查Buffer P2 中SDS 是否有析出,如果有在37℃水浴下溶解。

3.Buffer P3在4℃预冷。

4.选择:将Lyseblue 加入到Buffer P1,使用前混匀。

实验操作:

1.从新鲜的选择培养基上挑取单菌落,在含有抗性的2-5ml的LB培养基上培养。培养约8h, 37℃,摇床转速约300rpm。

——摇菌管的体积至少为培养物体积的4倍。

2.按1/500或者1/1000的比例用选择性LB培养基稀释培养液。对于低拷贝质粒,100ml培养基加入100-200ul起始培养液。培养约12h-16h,37℃,摇床转速约300rpm。

3.收获菌:4℃,离心15min,离心力6000*g。

4.用4ml Buffer P1 重悬菌体。

——如果加入lyseblue,使用前充分混合buffer P1。

——为了有效的裂解菌体,需使用足够大的容器,以使lysis buffer 从分混合。

——必需使菌体彻底重悬。

5.加入4ml buffer P2,迅速翻转管4-6次,室温下(15-25℃)静置5min。

——不能使用漩涡震荡,以免剪断基因组DNA。

——溶解液应当呈现出澄清。

——不能让溶解反应超过5min。

——使用完毕,buffer P2 需立即盖上盖子,防止空气中的二氧化碳酸化。

——如果buffer P1中加入lyseblue。加入buffer P2 后,细胞悬液会立即变蓝。混合后,会产生均一颜色的重悬液。如果悬液包含局部颜色区域或者褐色细胞团,需继续混匀混合液,直到产生均一颜色。

6.加入4ml预冷的buffer P3,立即混匀并彻底用力翻转4-6次,冰上孵育15min。——加入4℃预冷的buffer P3且冰上孵育后,析出加强。

——加入buffer P3后,形成白色沉淀,溶菌产物透视度降低。析出物中包括基因组DNA、蛋白、细胞破碎物和KDS。

——如果加入了lyseblue,悬液需要混合直到蓝色消失,变成无色。均一的无色悬液表明SDS 有效的析出。

7. 4℃下,离心30min,离心力≥20,000*g,迅速将含有质粒的上清转移到新的离心管。——离心前,样品应重新混合。需在非玻璃试管中离心。

——离心后重悬液应澄清。

8.将上清4℃下,再次离心15min,离心力≥20,000*g 。迅速将含有质粒的上清转移到新的

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